流式細胞術(shù)檢測的工作原理

在流式細胞術(shù)中使用的儀器稱為流式細胞分析儀，通常縮寫為“細胞分析儀"。流式細胞分析儀由一個用于進行細胞處理的流體系統(tǒng)和一個包括數(shù)據(jù)采集信號檢測器和處理器的光學系統(tǒng)組成。專為 FACS 設(shè)計的儀器還包含一個細胞分選組件，該組件可將細胞引導到不同的捕獲容器中。

流體系統(tǒng)設(shè)計用于生成單細胞的均勻流，以確保當細胞被用于檢測的光源照射時，能夠進行適當分析。這通過使用加壓管將細胞從樣品管注入流室中來完成。從容器（通常是一根試管或一塊多孔板）中抽取細胞樣品，并將其注入流動液體（稱為鞘液）層流中間的流室中。通過一個稱為流體動力學聚焦的流程，鞘液可幫助縮窄細胞流，從而將細胞組織成一行大致單行的流線。

流式細胞分析儀的光學系統(tǒng)包括照明源、過濾器、透鏡和收集光學器件。照明源常包括 1 個或多個激光束，且每個激光器發(fā)射的光波長不同。檢測器不區(qū)分各種光波長，而是通過放置在光路徑中的過濾器來將光限制在所需波長范圍內(nèi)。

流式細胞術(shù)檢測的工作原理：抗體、熒光團和細胞染料的重要性

為了通過流式細胞術(shù)分析特定靶標，對細胞組分進行熒光標記。這可以通過使用單獨的熒光分子（例如，細胞染料）或熒光團標記的抗體（直接偶聯(lián)抗體或使用偶聯(lián)二抗）來完成。

流式細胞術(shù)中抗體的使用

抗體是許多生物檢測中的關(guān)鍵工具，在流式細胞術(shù)中也不例外。抗體具有特異性結(jié)合單個蛋白或蛋白修飾的能力，并且可作為一種方法來標記那些用于進行檢測的靶標。通過標記目的靶標，研究人員可以評估各種細胞類型、疾病狀態(tài)、治療條件、發(fā)育階段或其他生物模型中蛋白的豐度或活性。

與不同蛋白結(jié)合的抗體不會相互干擾，因此，可以使用多種抗體同時檢測多個靶標。這稱為多重分析。抗體數(shù)量的限制是獨立于其他抗體測定每種抗體的能力。在流式細胞術(shù)中，這種差分測定使用稱為熒光團的熒光分子來完成。成功的實驗要求具有高度特異性和經(jīng)驗證的抗體以及可靠的熒光團。

流式細胞術(shù)中熒光團的使用

熒光團的共同特性是能夠發(fā)射與用于照亮染料的光相比波長更長的光。例如，如果使用藍色激光器來照亮稱為綠色熒光蛋白 (GFP) 的分子，那么蛋白會吸收藍光并發(fā)射綠光。被吸收的光與被發(fā)射的光之間的波長差異稱為斯托克斯位移。

就是這種位移讓人們能夠準確定量來自熒光團的光，因為它能夠過濾來自激發(fā)源的光的波長。激發(fā)源總是比從正在分析的熒光團中發(fā)射的熒光更亮些，并且如果這種光無法移除，那么它將會強烈影響檢測器。

熒光染料吸收的光的范圍稱為“激發(fā)"光譜，而激發(fā)時其發(fā)出的熒光稱為“發(fā)射"光譜。激發(fā)和發(fā)射光譜針對所有常見染料提供，并呈曲線顯示各波長下吸收或發(fā)射的光量。

流式細胞術(shù)中的偶聯(lián)抗體：直接與間接熒光團標記

通常，在流式細胞術(shù)實驗中用于獲取讀數(shù)的熒光團會與抗體共價結(jié)合。該過程稱為偶聯(lián)，并且該抗體-熒光團配對稱為偶聯(lián)物。當在一項細胞檢測中使用偶聯(lián)抗體時，熒光團發(fā)射的光可作為細胞內(nèi)或細胞上存在的抗體量的一個直接指標。（由于細胞膜是透光的，細胞內(nèi)熒光團發(fā)射的光不會顯著衰減。）通過使用特異性結(jié)合蛋白或蛋白修飾的偶聯(lián)物，研究人員可以根據(jù)每個細胞發(fā)射的熒光水平，直接量化該細胞中的目的靶標。該過程稱為直接檢測或直接流式細胞術(shù)。

直接：直接偶聯(lián)抗體

• 可直接多重分析來自同一宿主的抗體

• 由于孵育和洗滌步驟更少，因此實驗步驟更快

• 能夠在一項檢測中使用許多不同的抗體，從而能夠同時讀取大量終點

間接：非偶聯(lián)一抗 + 偶聯(lián)二抗

• 可改善以低豐度存在的靶標的檢測，同時由于二次放大可提供更高的靈敏度（多個二抗結(jié)合一個一抗）

• 當直接偶聯(lián)物尚未獲得時，有益于一抗的初始驗證

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